" /> " />
Kemi

Högtrycksvätskekromatografi (HPLC)


Detektionsprincip för brytningsindexdetektorn (avböjningsprincipen) i HPLC

<Seite 33 von 35>


Innehållsförteckning

Det är en kromatografisk separationsprocess där ämnet som ska undersökas pumpas tillsammans med en mobil fas (även kallad "eluent") genom en så kallad separationskolonn, som innehåller den stationära fasen. En separationskolonn i en HPLC-anordning är mellan 1,8 och 30 cm lång och har vanligtvis en innerdiameter på 2-4,6 mm i fallet med analytiska HPLC-system. Ibland kopplas en så kallad pre-kolonn uppströms av ekonomiska skäl, detta är en kort kolonn som ska hålla föroreningar borta från huvudkolonnen. HPLC används även för rening av ämnen som (semi-)preparativ HPLC. Innerdiametern kan vara betydligt större, eftersom rening kan utföras upp till produktionsskala.

Strukturen hos en typisk HPLC-apparat, reducerad till de väsentliga elementen, kan ses i den intilliggande figuren.

Om en komponent av ämnet som ska undersökas interagerar starkt med den stationära fasen, ligger den kvar i kolonnen under en relativt lång tid. Om den däremot samverkar svagt med den stationära fasen, lämnar den kolumnen tidigare. Beroende på styrkan av dessa interaktioner uppträder ämnets beståndsdelar vid olika tidpunkter (retentionstiderna) i slutet av separationskolonnen, där de sedan kan detekteras med en lämplig detektor Lösningsmedelsfilm runt alkylkedjorna hos den modifierade silikagel). Steget som bestämmer hastigheten är återgången till den mobila fasen.

Man skiljer på två metoder: normalfas (NP) och omvänd fas (engl. omvänd fasRP). En polär stationär fas (t.ex. silikagel / silikagel) används i NP-HPLC. Styrkan hos den mobila fasens elueringskraft är i allmänhet beroende av polariteten. De olika lösningsmedlen är ordnade i den elutropiska serien efter ökande polaritet. Ju mer polär en mobil fas, desto snabbare elueras ett ämne. Polära molekyler fördröjs (hålls kvar) längre på kolonnen än opolära molekyler och lämnar därför kolonnen senare.

RP-HPLC är den vanligaste metoden i praktiken. 70 % av alla analytiska HPLC-separationer är RP-separationer. En icke-polär stationär fas används här och elueringseffekten minskar med ökande polaritet. Den stationära fasen framställs genom att silaner som har ersatts med långkedjiga kolväten reageras med silikagel. Den polära ytan på kiselgelpartiklarna är belagd med ett opolärt skikt av alkaner, dvs polariteten är omvänd. Blandningar av vatten eller buffert och acetonitril eller metanol används vanligtvis som den mobila fasen. I fallet med isokratiska separationer förblir sammansättningen av den mobila fasen densamma under hela perioden. Vid gradientseparationer ändras lösningsmedelsblandningens polaritet under analysen. RP-HPLC används särskilt för separation av polära analyter som skulle ha för långa retentionstider på normala faser. En C18-kolonn (d.v.s. en oktadecylsilan som ett derivatiseringsreagens för silikagelen) används vanligtvis för detta, och detektion utförs vanligtvis med en UV- eller fluorescensdetektor.


HPLC-metod

Syftet med detta projekt var att utveckla en HPLC-metod som möjliggör identifiering och kvantifiering av organiska syror och alkoholer i vatten från hydrotermisk karbonisering (HTC).

Hos HTC reagerar substrat som innehåller kol (t.ex. växter) vid temperaturer på 150-350°C och tryck på 16-25 bar. Huvudprodukten är ett fast material med hög kolhalt. Biprodukter, till exempel furfuraler, organiska syror och aldehyder, stannar kvar i vattenfasen. Andra biprodukter är gasformiga (CO2CH4) [1, 2, 3]. Det finns redan många tillvägagångssätt (energiska, terra preta) för användningen av den fasta produktfasen; en liknande stor potential förväntas för den flytande fasen. Hittills har det dock inte funnits några tillförlitliga uppgifter om de exakta komponenterna i den flytande biprodukten.

Material och metoder

Ett framträdande LC-20AD HPLC-system från Shimadzu användes för metodutveckling, medan separationskolonnen var en Organic Acid Resin Column från CS-Chromatographie Service. Syrorna och alkoholerna som undersöktes var: Myrsyra (CH2O2), vinäger (C.2H4O2), Mjölk (C.3H6O3), Propionsyra (C.3H6O2), smör (C.4H8O2), Isobutter (C.4H8O2), Pentan (C.5H10O2) och isopentansyra (C.5H10O2Metanol (CH4), Etanol (C.2H6O), 1-propanol (C.3H8O), 1,2 propandiol (C.3H8O2), Butanol (C.4H10O), 2,3-butandiol (C.4H8O2).

Under den analytiska utvecklingen testades olika parametrar, t.ex. B. provberedning, sammansättning av den mobila fasen, flödeshastighet, temperatur, provinjektionsvolym och olika våglängder för UV-detektorn. Syftet var att separera topparna i kromatogrammet så tydligt som möjligt.

Organiska syror

Figur 1 visar ett exempel på kromatogrammen för ett HTC-vattenprov för två olika våglängder. Med hänvisning till våglängden som optimeringsparameter visar kromatogram B det bättre resultatet. På liknande sätt beräknades och jämfördes andra parametrar som golvhöjd, upplösning eller signal-brusförhållande för de olika topparna. I slutändan gav följande förhållanden de bästa resultaten [4]:

▪▪ Flödeshastighet mobil fas = 0,8 ml/min

▪▪ Den mobila fasens sammansättning: 0,2 ml/min H24 0,005 m + 0,6 ml/min milliporvatten

▪▪ Detektion: UV-detektor, extraktion vid 220 nm

▪▪ Provspädning 1: 4 HTC-vatten: Mobil fas

Med dessa förhållanden analyserades standarder med olika koncentrationer av de organiska syrorna för att erhålla kalibreringskurvor. För metodvalideringen beräknades gränsen för detektion (LOD) och gränsen för kvantifiering (LOQ) och noggrannheten i mätningarna bestämdes. Tabell 1 visar detektions- och kvantifieringsgränserna för de uppmätta syrorna. Detektionsgränsen för alla syror är mycket låg, i intervallet milligram per liter. Dessutom är de uppnådda kvantifieringsgränserna mycket låga, så att alla syror med en koncentration över 0,2 g / l kan kvantifieras - det enda undantaget här är mjölksyra. Tabell 1 visar även kvantifieringens noggrannhet för de uppmätta organiska syrorna, beräknad för tre uppmätta standarder. De flesta noggrannhetsvärdena ligger i intervallet ca 99 till 101 % - mätningarna med den bestämda metoden är därför tillförlitliga. Noggrannheten är bara lägre för mjölksyra.

De tidigare nämnda analytiska förhållandena testades för alkoholnormerna och en lägre känslighet konstaterades. Som ett resultat har metodparametrarna för alkoholmätning optimerats:

▪▪ Flödeshastighet mobil fas = 0,8 ml/min.

▪▪ Den mobila fasens sammansättning: 0,2 ml/min H24 0,005 m + 0,6 ml/min ultrarent vatten

▪▪ Detektering: UV-detektor. Extraktion vid 190 nm.

▪▪ Provspädning 1: 4 HTC-vatten: Mobil fas

Tabell 2 visar detektions- och kvantifieringsgränserna samt noggrannhetsvärdena för de undersökta alkoholerna. Detektions- och bestämningsgränserna är högre än för organiska syror (se tabell 1). Metoden för detektering och kvantifiering av organiska syror visar sig därför vara något bättre än metoden för alkoholerna. För alkoholerna är noggrannhetsvärdena i ett bredare spektrum, som mestadels går från 98 till 102 % (med undantag för propanol och butanol, se tabell 2):

Mätning av ett vattenprov från HTC

(Kylningstid 6 timmar, temperatur 200 °C):

▪▪ De valda randvillkoren var: utspädning 1:4, HTC-vatten: mobil fas.

▪▪ Mobil fas: 1:3, H24: Ultrarent vatten

Figur 2 visar resultaten för HTC-vatten med de bestämda metoderna: Av alla detekterbara komponenterna, metanol, mjölksyra, myrsyra, ättiksyra, propionsyra, i-smörsyra, n-smörsyra, n-valeriansyra, 1, dock 2-propandiol och 2,3-butandiol kvantifierade inte propionsyra på ett tillförlitligt sätt eftersom koncentrationen (0,08 g/l) är lägre än detektionsgränsen. Övriga koncentrationer ligger i intervallet från 0,5 g till 8 g/l. Ett fönster på 5 % av retentionstiden angavs för identifiering av ämnena, se tabell 3.

Dessutom korrigerades baslinjen för att förbättra mätningen [5]. De höga värdena på antalet plattor visade att kolonnen fungerade bra för alla föreningar. På grund av komplexiteten och den höga mängden föreningar i provet varierar separationsfaktorerna med ett värde på 1. Optimala värden bör dock vara i storleksordningen 2, så att en ytterligare förbättring av separationen av ämnen i vattenprovet är nödvändiga. Signal-till-brus-värdena är dock tillräckligt höga för att förhindra att brus påverkas av mätningarna, och utspädningen av proverna var inom ett bra intervall.

sammanfattning

De utvecklade metoderna möjliggör acceptabel identifiering och kvantifiering av flyktiga organiska syror och alkoholer i HTC-vattenprover. Detektionsgränsen var mycket låg för alla ämnen, vilket bevisar kolonnens goda prestanda och detektorns lämplighet för uppgiften. Identifieringen och kvantifieringen med en kalibreringskurva var bättre för syrorna än för alkoholerna, eftersom linjäriteten för denna kurva var högre för syrorna.

Huvudproblemet visade sig vara att på grund av HTC-vattnets komplexitet upptäcks ett stort antal andra föreningar. En nödvändig förbättring av metoderna är därför en mer komplex provberedning, t.ex. B. genom extraktion eller destillation. Ytterligare ett steg är utvecklingen av en metod som möjliggör detektering och kvantifiering av furfuraler, eftersom stora mängder av dem kan förväntas i HTC-vattnet på grund av de reaktioner som sker i HTC. Litteratur tillgänglig från författarna.


Tillämpningar av HPLC i modern fettanalys †

Plenarföreläsning med anledning av DGF-symposiet om "Mixtures and Adulterations in Edible Fats and Oils" i Hamburg den 8:e och 9:e november 1990.

Abstrakt

Även om detektionsproblemet för lipider ännu inte har lösts på ett tillfredsställande sätt, har HPLC också blivit allt viktigare inom området för undersökning av fetter och medföljande ämnen. Det finns redan många tillämpningar av HPLC inom fettområdet, som också kan användas för identifiering av fetter och för karakterisering av blandningar. Medan undersökningen av fettsyrasammansättningen och sterolerna har förblivit en domän av GLC, utförs undersökningar av triglyceridsammansättningen och olika andra fettkomponerande substanser nu i allt högre grad med hjälp av HPLC. Triglyceriden RP-HPLC tillåter separationer både enligt kedjelängden och enligt antalet dubbelbindningar i molekylen. Detta gör karaktäristiska skillnader synliga, även när det gäller fetter som endast skiljer sig något i fråga om deras fettsyrasammansättning. Idag används HPLC i stor utsträckning vid undersökning av tokoferoler och andra fettlösliga vitaminer. Även med andra karakteristiska fetttillbehör, med spårkomponenter som z. B. Klorofyllnedbrytningsprodukter och med föroreningar och tillsatser kan HPLC ge värdefull hjälp. I vissa fall tillåter bildandet av toppareaförhållanden uttalanden om ett fetts historia och tillstånd samt om blandningar och förfalskningar.

Abstrakt

Användningen av HPLC i modern fettanalys

Även om det allmänna lipiddetekteringsproblemet ännu inte har hittat en tillfredsställande lösning, är HPLC alltmer populärt för undersökning av fetter och deras mindre komponenter. Det finns nu många HPLC-tillämpningar som också kan visa sig användbara vid identifiering av fetter och karakterisering av fettblandningar. Medan fettsyra- och sterolundersökningar fortfarande är en domän av GLC, analyseras triglyceridkompositioner och vissa mindre komponenter vanligtvis med HPLC. Triglycerider separeras med RP-HPLC både enligt kedjelängd och antal dubbelbindningar. På detta sätt ses karakteristiska skillnader även i fetter som inte skiljer sig mycket med sin fettsyrasammansättning, HPLC används i stor utsträckning även vid undersökning av tokoferoler och andra fettlösliga vitaminer, samt för spårkomponenter som klorofyllnedbrytningsprodukter, föroreningar och tillsatser. HPLC-toppareaförhållanden kan tillåta slutsatser om ett fetts natur, dess ursprung och historia och möjlig utveckling.


Bestämning av inositolfosfater IP3 - IP6 i raps- och rapsmjöl med en HPLC-metod, del 1: Metod

En HPLC-metod för bestämning av fytinsyra och tre av dess nedbrytningsprodukter (IP3, IP4, IP5) i raps och rapsmjöl har utvecklats. Metoden är baserad på jonparkromatografi med en RP-8-Phase och tetrabutylammoniumhydroxid som jonparreagens. Metanol och två gånger destillerat vatten (1:1) används som mobil fas. Föreningarna detekteras av en RI-detektor. Variationer i retentionstider och toppareor undviks genom att termostatera detektorn, lösningsmedelsbehållaren och kolonnen vid 40 °C. Kalibreringen av systemet uppnås med ren fytinsyra. Olika responsfaktorer för inositolfosfaterna beräknades. En extraktionsmetod för inositolfosfater från rapsprover är optimerad. Inositolfosfaterna från rapsfrön extraheras med 0,5 M HCl vid 100°C och rensas upp med en jonbytarkolonn. Nedbrytning av inositolfosfater observeras inte under denna behandling.

Abstrakt

Bestämning av inositolfosfaterna IP3 - IP6 i raps och rapsmjöl med hjälp av en HPLC-metod, del 1: metod

En metod för bestämning av fytinsyra och tre av dess nedbrytningsprodukter (IP3, IP4, IP5) i raps och rapsmjöl utvecklades. Metoden är baserad på jonparkromatografi med en RP-8-fas och tetrabutylammoniumhydroxid som jonparreagens. Metanol och dubbeldestillerat vatten (1:1) används som den mobila fasen. Anslutningarna detekteras med en RI-detektor. Fluktuationer i retentionstiderna och toppareorna undviks genom att termostatera detektorn, lösningsmedlet och kolonnen till 40 °C. Systemet är kalibrerat med ren fytinsyra. Olika svarsfaktorer för inositolfosfaterna bestämdes. En extraktionsmetod för inositolfosfater från raps och rapsmjöl har optimerats. Inositolfosfaterna extraheras med 0,5 M HCl vid 100°C och renas med användning av en jonbytarkolonn. Ingen nedbrytning av inositolfosfaterna observeras.


Analytiska metoder för resorcinol-formaldehydhartser

De beskrivna analytiska metoderna kan skilja mellan formaldehyd-resorcinolhartser som endast skiljer sig mycket lite i molförhållandet formaldehyd/resorcinol.

Mängderna av monomer, dimerer och trimerer kan bestämmas genom gas-vätskekromatografi (GLC) och högtrycks-vätskekromatografi (HPLC). Medelkedjelängder kan beräknas både från gelpermeationskromatogram (GPC) och från 'H-NMR-spektra. Det senare kan också användas för att verifiera molförhållandet formaldehyd/resorcinol. 13C-NMR-spektra ger information om hartsernas struktur, de relativa mängderna av fri resorcinol och de relativa graderna av kondensation.

Det har konstaterats att hartser med ett lågt molförhållande av formaldehyd/resorcinol innehåller en stor mängd fri resorcinol och har en låg grad av kondensation.

Abstrakt

De beskrivna analytiska metoderna gör det möjligt att skilja hartser från varandra som endast skiljer sig mycket lite vad gäller molförhållandet formaldehyd/resorcinol. Monomer-, dimer- och trimermängderna kan bestämmas med hjälp av gaskromatografi (GLC) och högtrycksvätskekromatografi (HPLC). Medelkedjelängder kan beräknas från gelkromatogram (GPC) och från proton-NMR-spektra. Molförhållandet kan också kontrolleras med hjälp av den senare. Hartsernas struktur, de relativa mängderna av fri resorcinol och de relativa graderna av kondensation kan bestämmas från 13C-NMR-spektra.

Resultaten visar att hartser med lågt molförhållande formaldehyd/resorcinol innehåller mycket fri resorcinol och har en låg grad av kondensation.


Sammanfattning

Tillämpningen av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) i samband med identifiering och kvantitativ bestämning av karboxylsyror i aluminatvätskor från Bayerprocessen beskrivs. Förfarandet består av följande delsteg: Optimering av HPLC-fassystem för separation av syntetiska blandningar av karboxylsyror, bearbetning av aluminatluten, semi-preparativ isolering av ämnen, identifiering genom vätskekromatografi och genom masspektrometri, kvantitativ bestämning genom topphöjdsutvärdering med hjälp av externa standarder.


Abstrakt

HPLC har använts för analys av isotiocyanater, indoler och oxazolidintioner i raps och rapsmjöl. Proverna behandlades med myrosinas och de frigjorda hydrolysprodukterna extraherades med diklormetan. Separationen utfördes på en RP-18-kolonn med användning av ett gradientsystem med acetonitril och vatten. Användning av en programmerbar UV-detektor möjliggjorde detektering av föreningarna vid deras absorptionsmaxima på 210 respektive 240 nm. Responsfaktorer för åtta standardföreningar beräknades för 240 nm. Halten av glukosinolater beräknade med resultaten av denna metod visade en signifikant linjär korrelation (r = 0.9995 P. <0,005) med innehållet av glukosinolater utvärderat med resultaten av HPLC-metoden för desulfoglukosinolater.

Nyckelord: HPLC indoler isotiocyanater oxazolidintioner raps

Författare till vilken korrespondensen ska ställas (fax ++ 49 251 519275 e-post [email & # 160protected]).


Nyckelskillnad - HPLC vs LCMS

Låt oss först överväga vikten av HPLC och LCMS innan vi analyserar skillnaden mellan HPLC och LCMS. Kromatografi är en separationsteknik inom kemisk analys där provkomponenter separeras under passage genom ett kromatografiskt medium. Det inkluderar också interaktionen med provet, den stationära fasen och den mobila fasen. HPLC står för High Performance Liquid Chromatography och används som en vätskekromatografimetod inom analytisk kemi. Kombinationen av vätskekromatografi och masspektroskopi (LCMS) utvecklades för kvantitativ analys av utvalda biomolekyler och är, jämfört med HPLC, en mycket känslig, exakt och specifik testmetod. Detta är huvudskillnaden mellan HPLC och LCMC. Den här artikeln kommer att introducera dig till HPLC och LCMC, som handlar om kemisk analys och diskuterar skillnaderna mellan HPLC och LCMS.

Vad är HPLC?

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en populär separationsteknik inom analytisk kemi. Det används främst för att separera komponenterna, identifiera och kvantifiera varje komponent i en blandning. Tidigare var denna teknik känd som högtrycksvätskekromatografi eftersom den förlitade sig på pumpar för att strömma ett trycksatt flytande lösningsmedel innefattande provblandningen genom en kolonn packad med ett fast adsorbentmaterial. Varje enskild komponent i provblandningen interagerar olika med det fasta adsorberande materialet, vilket resulterar i olika flödeshastigheter för olika komponenter. Detta kan leda till separation av komponenterna när de rinner ut ur HPLC-kolonnen.

Vad är LCMS?

Vätskekromatografi-masspektrometri (LCMS) är en analytisk teknik som kombinerar vätskekromatografins fysiska separationsförmåga med masspektrometrins (MS) massanalysfunktioner. Vätskekromatografi är en separationsteknik och masspektrometri används för att analysera mass-till-laddning-förhållandet av laddade partiklar. Den fysiska separationen uppnås vanligtvis med HPLC och alternativt med LCMS, även känt som HPLC-MS. LCMS är en dominerande analysteknik som jämfört med HPLC har en mycket hög nivå av noggrannhet, känslighet och specificitet. Därför är det användbart i många applikationer som forskning, läkemedelsanalys, livsmedelsanalys, etc. LCMS används främst för att separera, detektera, identifiera och kvantifiera biokemiska egenskaper hos ett givet prov i närvaro av komplexa kemiska blandningar.

Vad är skillnaden mellan HPLC och LCMC?

Akronym och definition av HPLC och LCMC

HPLC: HPLC står för High-Performance Liquid Chromatography. Det är en separationsteknik som huvudsakligen används för att separera komponenterna, identifiera och kvantifiera varje komponent i en blandning.

LCMS: LCMS står för Liquid Chromatography and Mass Spectrometry. Det är en analytisk teknik som kombinerar vätskekromatografins fysiska separationsförmåga med masspektrometrins (MS) massanalyskapacitet.

Egenskaper för HPLC och LCMC

Klassificering

HPLC: Detta är endast en vätskekromatografimetod.

LCMS: Detta är en kombination av vätskekromatografimetoden och masspektrometrimetoden.

Effektivitet

HPLC: Jämfört med LCMS är HPLC-analys mindre effektiv och långsammare.

LCMS: Jämfört med HPLC är LCMS-analys effektiv och snabbare.

Känslighet

HPLC: Jämfört med LCMS är HPLC-analys mindre känslig.

LCMS: Jämfört med HPLC är LCMS-analys känsligare.

Specificitet

HPLC: Jämfört med LCMS är HPLC-analys mindre specifik.

LCMS: Jämfört med HPLC är LCMS-analys mer specifik.

Noggrannhet

HPLC: HPLC ger mindre exakta resultat än LCMS för bestämning av vissa kemikalier.

LCMS: LCMS ger mer exakta resultat än HPLC för bestämning av vissa kemikalier.

Komponent

HPLC: HPLC kan ses som en del av LCMS.

LCMS: LCMS kan inte betraktas som en del av HPLC.

Jonkälla

HPLC: Det finns ingen jonkälla i HPLC-instrumentet.

LCMS: Jonkällan finns i LCMS-instrumentet.

Ansökningar

HPLC: Joner, polymerer, organiska molekyler och biomolekyler kan analyseras med HPLC.

LCMS: Organiska molekyler och biomolekyler kan analyseras. I motsats till HPLC kan ofullständigt lösta blandningar undersökas med LCMS.

Drift

HPLC: Diagrammet för ett HPLC-instrument visas i figur 1 och inkluderar vanligtvis en autosampler, pumpar och en detektor. Provtagaren inför provblandningen i den mobila fasen (trycksatt blandning av lösningsmedel såsom vatten, acetonitril och/eller metanol) som överför den till kolonnen. Pumparna levererar önskat flöde och sammansättning av den mobila fasen genom kolonnen. Kolonnen är fylld med adsorbenten, som är en granulär fast partikel såsom kiseldioxid eller polymerer. Detektorn genererar en signal som är proportionell mot mängden provbeståndsdelar som finns i kolonnen, vilket möjliggör kvantifierbar analys av de valda provbeståndsdelarna. HPLC-instrumentet styrs och dataanalysen tillhandahålls av en digital mikroprocessor och applikationsprogramvara.

Figur 1: Diagram över HPLC-instrumentet

Figur 2: Diagram över LCMS-instrumentet

Sammanfattningsvis är HPLC en vätskekromatografimetod, medan LCMS är en kombination av vätskekromatografi och masspektrometri. Båda analysteknikerna har olika egenskaper, men kan användas för att identifiera och kvantifiera livsmedelskompositioner, läkemedel och andra bioaktiva molekyler.


Video: Sjøholt Gry - HPLC instrument (December 2021).